細(xì)胞分離常用方法
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,zui簡單的方法是采用1000r/min的TD4A低速離心機(jī)離心10分鐘,若懸液量大,可適當(dāng)延長離心時(shí)間,但速度不能太高,延時(shí)也不能太長,以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞,離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次,用培養(yǎng)基洗一次后,調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng),若選用懸液中某些細(xì)胞,常采用離心后的細(xì)胞分層液,因?yàn)?,?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。
二、實(shí)體組織材料的細(xì)胞分離方法
對于實(shí)體組織材料,由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,為了使組織中的細(xì)胞充分分散,形成細(xì)胞懸液,可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。
(一)機(jī)械分散法
所取材料若纖維成分很少,如腦組織,部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號針),使細(xì)胞通過針頭壓出,或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡便、快速,但對組織機(jī)械損傷大,而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。
(二)消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀),應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng),使團(tuán)塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時(shí)再采用機(jī)械法,用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散,制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液,接種培養(yǎng)后,細(xì)胞容易貼壁生長。
1、酶消化分離法
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶,其分離方法如下:
(1)胰蛋白酶分散技術(shù)
胰蛋白酶(簡稱胰酶)是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品,對蛋白質(zhì)有水介作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開,在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同,對細(xì)胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細(xì)胞的作用,取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長短等。
①細(xì)胞類型胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織,如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效,但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。
②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過測定而有效,但配制時(shí)必須新鮮,需保存在低溫冰箱中,消化時(shí)的pH和溫度都要適宜,否則會(huì)影響活力,細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān),zui終使用活力為1:200或1:250,56℃pH8.0時(shí)活力zui強(qiáng)。
該酶為粉劑,保藏時(shí)要防潮,室內(nèi)溫度不宜過高,保存時(shí)間不能太長,若粉劑結(jié)團(tuán)塊,說明該部分受潮或失效。
③酶的濃度胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時(shí),濃度可適當(dāng)提高,消化時(shí)間適當(dāng)延長。濃度高對細(xì)胞有毒性,而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖,若培養(yǎng)液中加入血清,其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
④溫度一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性zui強(qiáng),但由于對細(xì)胞有損害而不能被采用,常使用的溫度為37℃,通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍,但隨堿性的增加其活力也隨之減少,活性強(qiáng)分散快,細(xì)胞也容易被消化下來,消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.6~8.0之間,否則對細(xì)胞有損傷。
⑥無機(jī)鹽離子若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時(shí),可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時(shí)應(yīng)采用無鈣鎂離子的PBS配制。
⑦消化時(shí)間如果細(xì)胞消化時(shí)間過長,可以損害細(xì)胞的呼吸酶,從而影響細(xì)胞的代謝,一般消化時(shí)間為20分鐘為宜,冷消化時(shí)使用低濃度消化液,于4℃也可。
分離方法如下:
①冷消化將取得的組織用Hanks洗三次,剪成碎塊大小為4毫米左右,用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織,再加入0.25%的胰蛋白酶,搖勻后放4℃,次日再用Hanks液洗滌,棄去上清,共洗2~3次,然后,加入少量營養(yǎng)液吹打分散,細(xì)胞計(jì)數(shù),按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。
②多次提取消化法多次提取消化法有以下三種:
熱消化多次提取將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘,然后經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液,按合適的濃度分瓶培養(yǎng),然后將留下的未*消化的組織按上述方法操作,再消化提取細(xì)胞。
冷消化多次提取方法同上,只是消化溫度為4℃。
先熱消化后冷消化將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散,制成懸液,剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下,次日再提取細(xì)胞,分散成懸液,分瓶培養(yǎng)。
(2)膠原酶(Collagenase)消化法
膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶,對膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用,對細(xì)胞本身影響不大,可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率,zui終濃度200u/mL或0.1~0.3mg/mL。此酶消化作用緩和,無需機(jī)械振蕩,但膠原酶價(jià)格較高,大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。
經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織,由于上皮細(xì)胞對酶有耐受性,可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被*消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長,因此不必要再進(jìn)一步消化處理。
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見表4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間(小時(shí))有差異(見表4-2),以及兩者價(jià)格不等,有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用,同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶(對細(xì)胞表面糖基有作用),采用兩者的聯(lián)合消化作用,對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。
表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
項(xiàng)目胰蛋白酶膠原酶
消化特性適用于消化軟組織適用于消化纖維多的組織
用量 0.01%~0.5% 0.1~0.3mg/mL(200u/mL)
消化時(shí)間 0.5~2小時(shí)(小塊) 1~12小時(shí)
pH 8~9 6.5~7.0
作用強(qiáng)度強(qiáng)烈緩和
細(xì)胞影響時(shí)間過長有影響無大影響
血清、鈣、鎂離子有影響無影響
表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.5~1cm3)
酶種類較硬組織軟組織
4℃室溫 37℃ 4℃室溫 37℃
胰蛋白酶(0.25%) 24~48 1~6 1~2 12~24 1~2 0.5~1
膠原酶(200u/mL) 24 6 6.5 12 3 0.25
兩者聯(lián)合(對沖) 12~46 12~24 4~12 12~24 6~12 1~2
除上述兩種zui常用的消化酶外,還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶,近年來,還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。
2、非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是一種非酶消化物,又稱螯合劑或Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液,對一些組織,尤其是上皮組織分散效果好,該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物,利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離,缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀,有團(tuán)塊,常不單獨(dú)使用,但可與胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1),不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散,可降低胰酶的用量和毒性作用。
消化分離法的操作步驟:
(1)剪切把組織塊剪碎,呈1~5mm3大小的組織塊。
(2)加液漂洗將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜,自然沉降法)。
(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間(中間可輕搖1~2次),若組織塊膨松呈絮狀可終止,若變化不大可更換一次消化液,繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過長。
(4)棄去消化液采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
(5)漂洗將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入,中止消化反應(yīng),采用漂洗法洗2-3次后,加入*培養(yǎng)基。
(6)機(jī)械分散采用吸管吹打或振蕩法,使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng),若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。
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