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超微量分光光度計可用于核酸和蛋白質(zhì)的定量

更新時間:2019-05-10      點擊次數(shù):1596
     分光光度計是運用分光光度法對有機物開展酶聯(lián)免疫法定量分析的設(shè)備。因為核酸,蛋白酶聯(lián)免疫法及其病菌生長溶度的酶聯(lián)免疫法樣本量不大,因此超微量分光光度計應運而生。
    核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率很高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈DNA、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波長260nm,每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應消光因子。如:1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應的樣品濃度。除了核酸濃度,分光光度計顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。
    比色法蛋白質(zhì)定量,蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應蛋白質(zhì)濃度。比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry等幾種方法。BCA是一種較新的、更敏感的蛋白測試法,要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產(chǎn)生Cu+,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法,操作簡單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

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